样本经过适当的刺激或其他处理后，收集于离心管经过预冷的PBS清洗。根据目的蛋白类型和细胞数量加入细胞裂解液（1 mL/107个细胞），超声破碎后冰浴裂解，收集处理好的裂解液上清。取部分上清用于测蛋白浓度及制备Input对照。其余上清可立即用于后续IP实验，如暂时不用则建议按每管400μL分装小份冻存。

实验要点：

对于IP样本，一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，样品可以保存在-80℃。分装，避免反复冻融。

为了避免细胞内的酶降解目的蛋白，需要添加蛋白酶抑制剂。若涉及磷酸化信号转导的实验，需要加磷酸酶抑制剂（如NaF）。蛋白酶/磷酸酶抑制剂都需要现加至预冷的裂解液中。

对于Co-IP实验，尽量不超声或者减少超声时间（一般30s以内）。

② 组织裂解物的制备

解剖实验动物、取组织；液氮研磨或冰浴玻璃匀浆（较难研磨或耗时较长的组织，建议液氮研磨）。后续步骤与处理细胞时相似（超声破碎时间可稍长，但一般不超过5min）。

③ 蛋白浓度的测定

推荐使用商品化BCA蛋白浓度检测试剂盒（货号：PK10026）。

★ 详细步骤请参考《实验技术手册》“免疫印迹-蛋白定量”部分。

实验要点：

IP实验成功与否，第一步处理样品非常关键。IP实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，需要在保证蛋白天然状态的前提下，尽量提高可溶性蛋白的得率。因此，大部分情况下可选用较为温和的RIPA裂解液（中）。

如果IP背景较深，杂带较多，即非特异的蛋白也被IP下来了，可尝试选用裂解强度较高的裂解液。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则可能裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液。

2）对照设置

一般会设置Input和同型对照，以佐证实验结果的合理性。

Input作为阳性对照，无需进行免疫沉淀步骤，直接使用制备好的样本进行检测，以证明靶蛋白存在于样本中。

同型抗体作为阴性对照，使用同种属/类型的无关IgG进行IP, 体现蛋白与IgG结合的背景信号，以排除假阳性结果。如 兔IgG、鼠IgG、鼠 IgG1/2a/ 2b/ 3 等。以上同型对照 Proteintech 均可提供。

针对标签蛋白的转染过表达的IP/Co-IP，其阴性对照一般选择未转染该标签细胞制备的lysate，以体现不含标签的蛋白与IP捕获抗体结合的背景信号，排除IP假阳性结果。

3）Lysate预处理

这一步用于去除和beads非特异结合的蛋白。在实验前将样品先与不带抗体的介质进行孵育，从而将非特异结合的蛋白除去。

4）目的蛋白免疫沉淀

根据经验，传统多克隆或单克隆抗体分步孵育得率更高、效果更好、背景更干净。先将IP抗体与裂解物进行孵育（4℃翻转孵育过夜），一段时间后再加入beads进行孵育（4℃旋转2-4小时）。

实验要点：

应选用适合IP的抗体，可查找文献报道或厂家IP验证。IgM和IgA类的单抗不太适合做IP，因为其结合韧性比较差，不和protein A或者G结合。

如果捕获带标签的融合蛋白，推荐使用Nano-Trap系列产品，纳米抗体偶联琼脂糖珠或磁珠，无需考虑孵育顺序。同时Nano-Trap可将使用传统抗体至少9h的IP实验时间缩短至2-3h，其中30min即可基本捕获所有靶标蛋白。既省时又省心！可在文末查看详细产品及列表。

5）beads清洗

这一步用于去除游离的杂蛋白及非特异结合的蛋白。

常用的Wash Buffer：①PBS或TBS等，带有生理条件pH值和盐离子浓度的缓冲液；②低浓度（0.5-1%）温和的去污剂，如 NP-40, Triton-X-100等；③低或中强度的RIPA裂解液（一般首次实验不建议使用裂解液进行洗涤步骤操作，可能损失部分目的蛋白）。

实验要点：

出现非特异条带时可以：①增加NaCl 浓度，降低由离子静电引起的相互作用；②提高去垢剂浓度；③针对不同的样品，需要通过实验对缓冲液的成分进行优化。

6）洗脱

这一步将蛋白从beads上洗脱下来。常用的洗脱液：酸洗脱（0.1-0.2M甘氨酸缓冲液）、尿素洗脱液（质谱常用）、SDS sample buffer。

★ 洗脱详细步骤请参考《实验技术手册》IP部分。

实验要点：

酸洗脱背景干净、非特异结合少。SDS sample buffer洗脱法洗脱更彻底，信号会更强，但容易产生高背景；且洗脱后的产物只适合做WB分析检测。可根据实验需求进行选择。

7）目的蛋白检测

可采用WB、ELISA、质谱等方法进行目的蛋白检测。

★ WB和ELISA实验具体步骤请参考实验手册。

3. 常见问题解析

Lysate预处理是必须得步骤吗？

一般初次实验可省去此步，若结果背景较重，则推荐采用此步。如果lysate为IgG含量较高的组织样本，产物中大量IgG会干扰后续实验，建议不要省略此步。 如果捕获标签-融合蛋白 ，使用Nano-Trap系列产品，无需预清洗裂解物，操作更简单。

抗体捕获beads怎么选择？

可参考下表进行beads的选择。而Nano-Trap系列产品，纳米抗体已经偶联琼脂糖珠或磁珠，无需考虑beads选择。

WB检测抗体和二抗如何选择可以避免重轻链干扰？

检测抗体及二抗选择可参考下图：

如捕获标签-融合蛋白，小P推荐选择Nano-Trap系列产品，该产品偶联在beads上的是纳米抗体，即羊驼重链抗体可变区（VHH），因此使用普通二抗也无需担忧重轻链干扰。

GFP-Trap进行免疫沉淀实验，GFP融合蛋白被完全捕获，穿流液中无明显残留；且无传统IgG抗体重/轻链的干扰

4. IP金牌伴侣6.5折限时促销

作为IP实验的金牌伴侣——Nano-Trap系列产品，在IP实验中捕获标签-融合蛋白，特别是GFP及其衍生物，可谓是优点多多：亲和力高、抓取蛋白完全、无重/轻链干扰，还能30min基本捕获所有目的蛋白...一个手都有点数不下了，大家可以点击本段文字查看详细展示。

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